二重標識水法 その1への追記（水分子間のプロトン交換）

この記事を投稿した直後に兵庫医科大学の化学教室主任 福島和明教授に読んでもらいました。そのとき頂いたコメントに、「ブログでは、水のＯがCO₂を介して交換する経路について解説してありましたが、他に¹H ₂ ¹⁶Oと²H ₂ ¹⁸O の間でプロトンを交換することで形式的に¹⁶Oと¹⁸Oが交換する経路はないでしょうか」とありました。Wikipedia（https://en.wikipedia.org/wiki/Doubly_labeled_water#cite_note-5）にも、水分子間の水素の交換（水分子のイオン化を介する）が起きるので、普通の水に重い同位体を含む水を混ぜると、短時間に同位体平衡に達する旨の記載がありました。しかし、その当時調べた書物（参考資料1）で、H₂Oの解離反応の反応速度定数が2.5×10^－5ｓ^－1 (25℃)であることを知りました。この値から半減期を求めると7.7時間となり、イオン化反応は速やかでありません。それ故このブログで、水分子間の水素交換のことを触れずにおりました。

ところが、最近たまたま手にした本（参考資料２）に、ヒドロニウムイオン（H₃O⁺）およびOH^－と中性の水分子との間に速いプロトン移動が起きると述べられており、このプロトン移動の2次反応速度定数が示されていました。そこで、すべての水分子の水素原子が交換しあうのに要する時間を計算してみたところ、0.1秒に満たない値が得られました。したがって、二重標識水と体水分間の同位体平衡は、同程度の時間で達せられることになります。以下に、この結論に至った根拠を説明します。

水中ではH₃O⁺から水分子へのプロトン移動および水分子から^－OHへのプロトン移動が起きます。

H₂O + H₃O⁺ → H₃O⁺ + H₂O　・・・・反応1

H₂O + OH^－ → ^－OH + H₂O・・・・反応２

これらの反応の2次反応速度定数は、それぞれk₁ = 1.06 × 10¹⁰ M^－1ｓ^－1とk₂ = 3.8 × 10⁹ M^－1ｓ^－1です。より速やかに進む反応1によるプロトン交換の速度について考察を進めます。
H₂O分子全体が反応1を介してプロトン移動を行う（「経験する」と擬人化して表現した方が分かりやすいと思われる）過程が、どのようなタイムスケールで進むかを計算してみましょう。中性の水には平衡状態で常に10^-7 MのH₃O⁺が存在し、このH₃O⁺が触媒的に働いてH₂O分子全体がプロトン移動を促進します。この過程は、[H₃O⁺]が一定であるため見かけの速度定数が  k₁×[H₃O⁺] の1次反応で表されます。 k₁×[H₃O⁺] の値は(1.06×10¹⁰)×10^－7 = 1.06×10³ｓ^－1です。

上記の議論を踏まえて、ある時点で存在したH₂O分子全体の99%がプロトン移動を経験するのに要する時間を求めてみます。ｔ= 0におけるH₂Oの濃度をx₀、t ＝ tにおいてプロトン移動を行っていないH₂Oの濃度をｘとすると、ｘの減少速度は一次反応式

-dx/dt ＝ k₁[H₃O⁺]x

すなわち                       　　　 -dx/dt ＝1.06×10³ x

で表されるので、変数を分離し、ｔ= 0 で x = x_0、t ＝ t で x = x の境界値で積分して

log_e(x/x₀) = -1.06×10³ｔ

となります。反応が99％まで進む時間は、この式でx/x₀ = 0.01とおいて、t = 4.34×10^－3 sと計算されます。

反応1で生成したH₃O⁺は、そのプロトンを次の水分子に与えてH₂Oとなります。このとき、反応1で移動したプロトン（転移プロトンと呼ぶことにします）は2/3の確率でH₂Oに取り込まれるので、第一ラウンドのプロトン移動反応で全体の2/3の水分子に、転移プロトン1個が移ります。第二ラウンドの反応で、転移プロトンを取り込んだ2/3のうちの2/3に転移プロトンが入りますが、残りの1/3の水分子は転移プロトン1個のままです。第二ラウンドのプロトン移動によって完全にプロトン交換した水ができるのは、プロトンを受け入れた水の半分です（第一ラウンドで取り込まれたプロトンが第二ラウンドのプロトンと入れ替わる確率が1/2であるので）。残り半分は転移プロトン1個のままです。さらに、第一ラウンドで転移プロトンの入らなかった残りの1/3の水分子には、確率2/3で転移プロトン1個が入り、上記のようなプロトン交換が起きます。このような過程を続けていったとき、第nラウンドの後に、転移プロトン0個ないし1個の水分子の占める割合は、
(1/3)ⁿ + (2/3)ⁿ + (1/3) (2/3)^n-1 + (1/3)² (2/3)^n-2 + … + (1/3) ^n-2 (2/3) ² + (1/3) ^n-1(2/3)

で表されます。n = 14のときの値は、0.0069となりプロトン交換が99％以上進みます。先に計算したように1ラウンドの反応は4.34×10^－3 sで終わるので、水分子全体のプロトン交換にはその14倍の6.08×10^－２ sかかることになります。

　このように水分子のプロトン交換が0.01秒のオーダーで進むことが分かりました。²Hは¹Hに比べて重いため交換速度は若干遅くなるでしょうが、二重標識水と体水分間の同位体平衡は、0.1秒位で達せられると考えられます。

参考資料

1）I. AMDUR・GORDON G. HAMMES 著、三山 創・浅羽哲郎 訳「化学反応速度論―基礎概念と最近のトピックス―」、共立出版、1971年

2）H.アイリング・E.M.アイリング 著、 長谷川繁夫・平井西夫 訳「反応速度論 」、共立出版、1964年

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二重標識水法 その６ 補遺

二重標識水法（その４）において、グルコースの完全酸化の反応式を次のように表しました。

C₆H₁₂O₆ + 8 H₂O → 4 COO + 2 COO + 2 H₂O  + 16 H⁺ + 8 H⁺ + 24 e^-・・・反応式11

CO₂と H₂OができるときC、H、Oの各原子がグルコースとH₂Oのいずれに由来するかに着目して、この式ではグルコース由来のものを赤色、H₂O由来のものを黒色で示しました。実は、この反応式は仮想的なものです。現実には、この通りの変化は起きないので、誤解がないように一言付け加えます。

初めに、説明の便宜のために、二重標識水法(その1)の図2と3を再掲します。

図２

図3

　そもそも、反応式11はCO₂のO原子の由来に着目して導いいたものです。そのとき、クエン酸回路の反応で、アセチルCoAのアセチル基に由来するOをグルコース由来と記しました。しかし、これは、グルコースがピルビン酸に代謝される過程で、グルコースのOが溶媒のH₂OのOと入れ替わるので厳密には正しくありません。ましてやアセチル基のHの由来はとても複雑です。そもそも、グルコースのOH基のHは溶媒のH₂Oとの間でプロトン交換が起きます。さらに、グルコースのHとOは代謝経路の途中で溶媒のH₂OのHとOと入れ替わるステップがあるため、反応経路中間体のHとOは元のグルコースの原子と同じとは限りません。そこで、経路の反応で基質が生成物に変わるとき、分子式の上で基質のHとOが生成物にとどまるものを「グルコース由来」とみなします。例えば、解糖系の反応2（グルコース6‐リン酸↔フルクトース6‐リン酸）で炭素骨格のHが部分的にH₂Oとの間でプロトン交換をしますが、フルクトース6‐リン酸のHはすべて「グルコース由来」とします。反応5（ジヒドロキシアセトンリン酸↔グリセロアルデヒド3‐リン酸）でも同様なことが起きますが、両トリオースリン酸のHはすべて「グルコース由来」とします。また、反応9と反応10によって、3‐ホスフォグリセリン酸のC2のHがH₂Oとして遊離し、ピルビン酸のC3に溶媒からH⁺が入ってメチル基 となりますが、このメチル基のHも「グルコース由来」とします。それ故、アセチルCoAのアセチル基は「グルコース由来」ということします。このような仮定の下に反応式11を見てください。グルコース（C₆H₁₂O₆ ）の水素と酸素だけから水ができることはありません。つまりH₂O はできませんが、反応9で2‐ホスフォグリセリン酸の水素と酸素を使って水ができるので、これをH₂O と表したと考えてください。

　今回は、グルコースが代謝されるときにそのHとOが実際に溶媒H₂OのHとOと交換する反応を調べてみます。参考にした文献を初めに掲げておきます。

20. Model P, Ponticorvo L, Rittenberg D: Catalysis of an oxygen-exchange reaction of fructose 1,6-diphosphate and fructose 1-phosphate with water by rabbit muscle aldolase, Biochemistry, 7,1339-1347(1968)

21. Lowe G, Pratt RF: Proton exchange of the pro-S hydrogen at C-1 in dihydroxyacetone phosphate, D-fructose 1,6-bisphosphate and D-fructose 1-phosphate catalysed by rabbit-muscle aldolase, Eur. J. Biochem., 66, 95-104 (1976)

22. O'Donoghue AC, Amyes TL, Richard JP: Hydron transfer catalyzed by triosephosphate isomerase. Products of isomerization of dihydroxyacetone phosphate in D₂O, Biochemistry, 44, 2622-2631(2005)

23. Rose IA, O'Connell EL: Intramolecular hydrogen transfer in the phosphoglucose isomerase reaction, J. Biol. Chem., 236, 3086-3092(1961)

24. Zhang BL, Yunianta, Martin ML: Site-specific isotope fractionation in the characterization of biochemical mechanisms. The glycolytic pathway, J. Bio.l Chem., 270, 16023-16029 (1995)

図11．アルドラーゼの反応。　H₃N^＋－Eは活性部位にあるリシン残基のε‐アミノ基を、^－OOC－Eは活性部位のグルタミン酸残基のγ‐カルボキシル基（解離型）を表す。^－OOC－Eはエナミン中間体ができるときに遊離するH⁺を受け取ってHOOC－Eとなり、そのHが中間体の二重結合の炭素に結合する。電子対の移行を示す矢印の向きは右向きの反応に対応する。
 http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/reaction/polysacc/41213.html　を改変。

1．グルコースのOが交換する反応

解糖系の反応4（アルドラーゼの反応）の反応機構を図11に示します。まず基質フルクトース1,6‐ビスリン酸のケト基と活性部位リシン残基のε‐アミノ基の間で脱水が起き、シッフ塩基ができます。続いて生成するエナミン中間体のC3-C4結合が開裂すると、グリセロアルデヒド3‐リン酸が遊離して残った部分はジヒドロキシアセトンリン酸のシッフ塩基に変わります。このシッフ塩基が加水分解してジヒドロキシアセトンリン酸が遊離します。この一連過程でフルクトース1,6‐ビスリン酸のケト基のOが水のOと交換します。基質が生成物であるジヒドロキシアセトンリン酸およびグリセロアルデヒド3‐リン酸と共存して平衡状態にあると交換反応はより速やかに進むことが観測されています（文献20）。また、フルクトース1,6‐ビスリン酸やジヒドロキシアセトンリン酸のケト基のOは、自然に水のOと交換する性質があり、交換反応のｔ_1/2は、前者が30分、後者が1分以下です（文献20）。したがって、反応５によってグリセロアルデヒド3‐リン酸のOH基のOもジヒドロキシアセトンリン酸のケト基のOに変わるので水のOと交換することになります。

2．「グルコース由来」のHが溶媒のH⁺と交換する反応

①反応4を触媒するアルドラーゼがジヒドロキシアセトンリン酸と溶媒のH₂Oとの間で立体特異的にH⁺を交換する反応を触媒することが知られています。これは、ジヒドロキシアセトンリン酸と活性部位のリシン残基との間で作られるシッフ塩基が、エナミン中間体に変わるときに引き抜かれるH⁺（図11のHOOC-EのHとなる）が溶媒のH₂Oと交換するためです（文献21）。

図12．グルコース6‐リン酸イソメラーゼとトリオースリン酸イソメラーゼの反応。ケト‐アルデヒド相互変換を触媒するのにグルタミン酸のγ‐カルボキシル基が使われる。図中のE-COO^－は解離型、E-COOHは非解離型のカルボキシル基を表す。文献22の本文中にある反応式を改変。

②反応2（グルコース6‐リン酸とフルクトース6‐リン酸との間の異性化）と反応5（グリセロアルデヒド3‐リン酸とジヒドロキシアセトンリン酸との間の異性化）は、ともにアルデヒドとケトとの異性化反応で、図12に示すように、基質がエンジオール（解離型）中間体を経て生成物ができます。反応5の場合には、グリセロアルデヒド3‐リン酸は、C2のHがH⁺として引き抜かれて活性部位のグルタミン酸残基のカルボキシル基（解離型）に移り、エンジオール（解離型）中間体に変わります。カルボキシル基に移ったH⁺がエンジオール（解離型）中間体のC1位に移ってジヒドロキシアセトンリン酸が生成します。この反応の途中でカルボキシル基に移ったH⁺が部分的に溶媒のH⁺と部分的に交換することが、グリセロアルデヒド3‐リン酸をD₂O中で酵素反応を行わせる実験で明らかにされています。文献22の実験条件では、交換の割合は約半分でした。似たことが反応2の場合にも起きます。

図13．C2位の水素を³Hで標識したクエン酸を基質としたアコニターゼの反応。最初のステップで、酵素の活性部位の塩基によってクエン酸C2位の³Hがとして引き抜かれ、シス‐アコニット酸ができる。このときOH^－も遊離する。塩基に受け取られた³Hがシス‐アコニット酸のC3位に付加されて、イソクエン酸ができる（左側縦矢印下向きの反応）。酵素反応中間体（[  ]で括った状態）からシス‐アコニット酸が遊離することがあり、塩基に受け取られた³Hが別のシス‐アコニット酸に付加してイソクエン酸ができることがある（右側横矢印左向きの反応）。また、塩基に受け取られた³Hが溶媒のH^＋と交換すると、このH^＋が新たに酵素と結合したシス‐アコニット酸に付加されて³Hを持たないイソクエン酸またはクエン酸ができる反応も起きる（右側縦矢印下向きの反応）。化学式中のの　　「－＜」はCOOHを表す。文献23の本文中の反応スキームを改変。

③アコニターゼが触媒する反応13には、H₂Oの出入りが起ります。クエン酸の脱水によってシス‐アコニット酸ができ、この反応中間体の二重結合にH₂Oが付加してイソクエン酸ができます。クエン酸のC2位とイソクエン酸のC3位の水素を同位体²Hや³Hで標識した化合物を用いた実験の結果から、図13に示すような反応が起きると考えられました（文献22）。C2位に³Hを持つクエン酸からイソクエン酸ができる反応では、シス‐アコニット酸ができるとき、クエン酸の脱水反応で³Hが活性部位の塩基に引き抜かれます。このとき生成する共役酸の解離は遅いため、共役酸から³Hが酵素に結合しているシス‐アコニット酸に付加されてC3位に³Hを持つイソクエン酸が生じます。つまり、クエン酸からイソクエン酸への反応で水素の分子内転移が起きます。一方、途中でシス‐アコニット酸が酵素から遊離すると、すでに蓄積していたシス‐アコニット酸が³Hを担った酵素に結合して、イソクエン酸を生成する反応が進みます。また、酵素の共役酸の³Hが溶媒のH^＋と交換してから、シス‐アコニット酸が酵素と反応すると、C3位にHを持つイソクエン酸ができます。なお、イソクエン酸C2位に¹⁸Oで標識した水酸基を持つ化合物を使った実験によって、生成するクエン酸に¹⁸Oが取り込まれないことが観察されました。

これらの反応以外に、グルコースの完全酸化の代謝経路には、明白にH₂OやH⁺が中間体に取り込まれる反応があります。それらは二重標識水法（その1）の図2と3に示しています。

④反応6において P_i（HOPO₃^2－）のO原子1個が1,3‐ビスホスホグリセリン酸のカルボキシル基のOとなり、ピルビン酸のカルボキシル基のOとなります。

⑤　2‐ホスフォグリセリン酸がピルビン酸に変わる過程（反応9と反応10）において3‐ホスフォグリセリン酸のC2のHがH₂Oとして遊離し、ホスフォエノールピルビン酸のC3に溶媒からH⁺が入ってピルビン酸のメチル基 となります（（その１）の図2を参照）。

⑥　 反応12において シトリルCoAの加水分解で使われるH₂OのO原子は、クエン酸のカルボキシル基に入ります。しかし、H原子はCoASHのHとH⁺となり、中間体には取り込まれません。

⑦　反応14においては、イソクエン酸が先ずNAD⁺によって脱水素されて反応中間体オキサロコハク酸が生成し、次に中央炭素に結合するカルボキシル基がCO₂として遊離します。その結果できたエノール（解離型）中間体の中央の炭素原子にH⁺が結合してα‐ケトグルタル酸ができます。

⑧　反応17と18が進行すると、コハク酸の炭素骨格から2原子のHがコハク酸脱水素酵素（反応17）によって除かれ、フマラーゼ（反応18）によってフマル酸にH₂O 由来のHとOHが結合してリンゴ酸ができます（（その１）の図３を参照）。

ところで、（その１）の図3には、H⁺が反応11と15において反応途中で入ることが示されています。このH⁺は、二重標識水法（その3）の図6に示すように、炭素骨格に結合せず、最終的にNAD⁺の還元にかかわります。

以上述べたように、グルコースが代謝されるときに、溶媒H₂Oの原子と交換する反応がたくさんあって、元のグルコースの原子の多くが、最終的にH₂O とCO₂ができるときには溶媒H₂Oと交換していることになります。酵母によるエタノール発酵を調べた研究では、エタノールのメチル基の水素の約50％が水に由来するという結論でした（文献24）。したがって、反応式11は、単純化しすぎた表現であるとのそしりをまぬかれませんが、解糖系でH₂Oが2分子生成することを包含させたかったのです。

今回は、二重標識水法（その４）で述べたことが正確でなかった点を繕いました。同時に、グルコースが代謝されるときにグルコースと溶媒H₂Oの間で起きる原子の交換について述べました。アルドラーゼ、イソメラーゼおよびアコニターゼの反応については、簡略な反応機構の図示にとどめ、酵素の三次元構造に基づいた詳細な説明は割愛しました。関心のある方には、次のウェブサイトの記事が役立つと思います。

アルドラーゼ：http://proteopedia.org/wiki/index.php/Aldolase

イソメラーゼ：http://proteopedia.org/wiki/index.php/Triose_Phosphate_Isomerase

アコニターゼ：https://en.wikipedia.org/wiki/Aconitase

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二重標識水法 その５ 脂肪酸の完全酸化

今回は、脂肪酸の完全酸化におけるH₂Oの関与について考察してみます。炭素数16の脂肪酸であるパルミチン酸を例にして、先ず、その化学的な燃焼を考えます。その反応式は次のようになります。

C₁₆H₃₂O₂ + 23 O₂ → 16 CO₂ +16 H₂O・・・反応式12

パルミチン酸の酸化が生体で起きる場合には、代謝経路の中間体にH₂Oが取り込まれつつ脱水素反応が起きます。そこで、パルミチン酸の酸化を形式的に二つの反応に分けて表します。まず、パルミチン酸の炭素原子をCO₂に酸化する反応が進行します。

C₁₆H₃₂O₂ +30 H₂O →16 CO₂ + 92 H⁺ + 92 e^－   ・・・反応式13

パルミチン酸がH₂O と反応して、CO₂を生成する過程で脂肪酸からH原子（H・＝ H⁺ + e^－）が取り出されて、H₂OのO原子がCO₂のO原子になります。この過程は、β酸化とクエン酸サイクルが行います。続いて、O₂分子を還元してH₂Oを生成する次の反応が続いて起きます。

92 H⁺ +92 e^－ +23 O₂ → 46 H₂O　　・・・反応式14

この反応は、ミトコンドリアの電子伝達系によって行われ、ATP合成のためのエネルギーが取り出されます。反応式13でH₂Oが30分子使われ、反応式14で46分子できるので、正味16分子のH₂Oが生成します。

図９．脂肪酸の活性化。 A, 脂肪酸の活性化のメカニズム。B, 脂肪酸活性化反応の生成物であるAMP、PP_i 、H⁺、および脂肪酸の解離でできるH⁺からATPとH₂Oが生成することを示す。詳細は注１）参照。https://ja.wikipedia.org/wiki/%CE%92%E9%85%B8%E5%8C%96#/media/File:Activation_of_fatty_acids.pngをベースにして作成。

図10．脂肪酸のβ酸化。パルミチン酸の場合、反応1から4の過程が7回繰り返される。「原書３版　医学のためのコア生化学」D.B. Marks著、伊藤誠二ら訳（丸善）の図を改変。

ところで、このように進行するパルミチン酸の完全酸化も、化学的な燃焼と同じ反応式12で表すことができるはずです。このことを確認しましょう。実際に体内で起きる脂肪酸酸化の化学変化は、図9Aと10で示すように進みます。反応式で表すと次のようです。

①     脂肪酸 + CoA-SH + ATP → アシルCoA + AMP + PP_i + H⁺・・・反応式15

②     アシルCoA（C: n個）+ FAD → trans-Δ²-エノイルCoA + FADH₂

③     trans-エノイル-CoA + H₂O → L-3-ヒドロキシアシルCoA

④     L-3-ヒドロキシアシルCoA + NAD⁺ → 3-ケトアシルCoA + NADH + H⁺

⑤     3-ケトアシルCoA + CoA-SH → アセチルCoA + アシルCoA（C: n₋2個）

   

①の反応式の脂肪酸はカルボキシル基が解離した型（RCOO^－）です。この反応は脂肪酸の活性化で、そのメカニズムを図9Aに示します。先ず、脂肪酸のカルボキシル基がATPのα位リン酸に結合してアシルAMPが中間体として生成してPP_iが遊離します。続いて、CoA-SHのチオール基がアシルAMPのカルボニル炭素を攻撃し、アシルCoAと AMPが生成します。このときチオールからH⁺が遊離します。①の反応を完全に進行させるのは、PP_iのピロホスファターゼによる加水分解で生じるエネルギーです。反応式15だけ見ると、ATPのエネルギーを使って脂肪酸とCoA-SHの間でチオエステル結合を作る反応に見えます。ここで、反応産物のAMP、PP_iおよびH⁺から反応に使われるATPを生成する反応（図9Bに示す）を考えると、①の反応は、カルボキシル基が非解離型の脂肪酸（RCOOH）とCoA-SHとの間で起きる脱水縮合で置き換えることができます。脂肪酸がパルミチン酸の場合、次の化学式のようになります^注１）。

パルミチン酸（RCOOH）+ CoA-SH → パルミトイルCoA + H₂O・・・反応式16

この反応はサイトゾルで行われ、アシルCoAはミトコンドリア内膜を通過し、マトリックスにおいて酸化されます。この酸化は脂肪酸のβ位でおきるのでβ酸化と呼ばれ、上記の②から⑤の反応の繰り返しによって進みます。パルミチン酸の酸化では、パルミトイルCoAから出発し、7回繰り返されます。パルミトイルCoAの酸化のバランス式は次のようになります。

パルミトイルCoA + 7 FAD + 7 NAD⁺ + 7 CoA-SH + 7 H₂O →

     8 アセチルCoA + 7 FADH₂ + 7 NADH + 7 H⁺・・・反応式17

8 アセチルCoAがクエン酸サイクルで代謝される反応は、「二重標識水法（その1）」の反応式６の両辺を8倍して、

8 アセチルCoA +24 NAD⁺ + 8 FAD + 8 GDP +8 Pi + 16 H₂O →

                      　　　　　　16 CO₂ +24 NADH +8 FADH₂ + 8 GTP + 16 H⁺ + 8 CoA-SH

となります。この式と反応式16および17の両辺をそれぞれ加え合わせると、反応式13に対応した式が得られます。

パルミチン酸（RCOOH）+ 31 NAD⁺ + 15 FAD + 8 GDP +8 Pi + 22 H₂O →

                   　　　　　　                 16 CO_２ +31 NADH +15 FADH₂ + 8 GTP + 23 H⁺ 

左辺の8 GDPと8 Piは、次式ように 8 GTPの加水分解反応によって生成します。　

8 GTP + 8 H₂O → 8 GDP +8 Pi + 8 H⁺

これら二つの反応式の両辺をそれぞれ加えると、反応式13に対応した次の式が得られます。

パルミチン酸（RCOOH）+ 31 NAD⁺ + 15 FAD + 30 H₂O →

       16 CO₂ +31 NADH +15 FADH₂ + 31 H⁺・・・反応式18

この反応でできる　31 NADHと15 FADH₂ が電子伝達系を介してO₂を還元してH₂Oを生成します。この反応は、次式のようになります。反応式14に対応する反応です。

31 NADH +15 FADH₂ + 31 H⁺ + 23 O₂ → 31 NAD⁺ +15 FAD + 46 H₂O

これら二つの反応式の両辺をそれぞれ加えると、反応式12になります。これで、脂肪酸の生化学的な酸化が脂肪酸の化学的な酸化（反応式12）と同じであることが確認できました。

次に、脂肪酸の完全酸化で生じるCO₂のOの由来を調べてみます。パルミチン酸の炭素原子が酸化されてCO₂を生成する反応は、形式的に反応式13で表されます。一見、パルミチン酸の2原子のＯとH₂O由来の30原子のＯによって16 CO₂ができるように見えますが、実際はパルミチン酸の由来Ｏは1原子で、あとはすべてH₂Oからです。事実、反応式18で示されるように31 H₂Oが使われます。この点を考慮すると、反応式13を次のように表すことができます。

C₁₆H₃₂O₂ +31 H₂O →15 CＯＯ + COＯ + HHO + 31 H⁺ + 61 H⁺ + 92 e^－

この式のHHOの二つのＨは、反応式16で示されるようにパルミチン酸のカルボキシル基とCoA-SHに由来します。CoA-SHのＨは、アセチルCoAがクエン酸サイクルに入る段階でH₂Oから入るので、H₂O由来です。また、92 e^－は、パルミチン酸のC:H結合およびC:C結合の電子対に由来します。

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注１）図9Bに書かれた化学変化を個別に表すと次のようになります。

(a）脂肪酸カルボキシル基の解離

   脂肪酸（RCOOH）⇌ 脂肪酸（RCOO^－）+ H⁺

(b) 脂肪酸の活性化

脂肪酸（RCOO^－）+ CoA-SH + ATP ⇌ アシルCoA + AMP + PP_i + H⁺

(c) ピロリン酸の加水分解

PP_i + H₂O → 2 HOPO₃^-2

(d) アデニル酸キナーゼによるリン酸基転移

AMP + ATP ⇌ 2 ADP

(e) ミトコンドリアにおけるATP合成酵素の反応

2 ADP + 2 HOPO₃^-2+ 2 H⁺ ⇌ 2 ATP + 2 H₂O

これらすべての式の両辺をそれぞれ足し合わせると、反応式16となります。(b)で使われるATPを、生成物であるAMP、PP_i 、H⁺、および(a)で遊離するH⁺から作るとき、H₂Oが生成します。このH₂Oが反応式16のH₂Oに相当します。実際、図9Aに示すように脂肪酸のカルボキシル基のO 原子がAMPのリン酸基のOとなり、このAMPが代謝される過程でH₂Oが生成します。本文中のカラーで表した化学式においてこのH₂OをHHOで示しました。

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